中央研究院 生物化學研究所

工欲善其事，必先利其器！中央研究院冷凍電子顯微鏡中心與國立中央大學合作，運用冷凍電顯技術，以原子級的解析度[註1]分析出酵素的蛋白質構造。研究成果有助於透過基因工程，生產更多生質燃料。論文已於4月17日刊載於《美國化學學會期刊》（Journal of the American Chemical Society），期刊並將研究成果選為當期封面，呈現如藝術創作般、蛋白質酵素的3D立體結構圖。

冷凍電子顯微鏡讓溶液中的生物分子結構能以高解析度呈現，為科學界帶來了重大突破，於2017年獲得諾貝爾化學獎的殊榮。2018年，中研院與臺灣蛋白質計畫合購了一組最先進的高解析度冷凍電子顯微鏡，並成立「中央研究院冷凍電子顯微鏡中心（ASCEM）」。隨後，高規格的儀器吸引全國及海外研究團隊前來申請使用。本次研究成果即為國立中央大學生命科學系陳青諭助理教授，與冷凍電顯中心主持人中研院生化所特聘研究員蔡明道院士合作的成果。

過去，科學家若要研究蛋白質的原子結構，必須先將蛋白質結晶，再以X光繞射成像。然而，並非所有蛋白質狀態都可以被結晶。冷凍電子顯微鏡透過低溫方式固定蛋白質，省去結晶化的過程與限制，並用電子顯微鏡提高解析度到原子的等級，有助於把蛋白質看得更清楚！本次研究團隊即藉此技術揭露了硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus之熱穩定性酮醇酸還原異構酶（ketol-acid reductoisomerase, KARI）的四種狀態的結構，更瞭解酵素的活性如何受到酸鹼值所影響。

蔡明道院士為酵素專家，於2012年獲選為中研院院士。蔡院士表示：「中研院冷凍電顯中心已具世界一流的等級，若善加利用此設施，將可望做出世界一級的研究。本次研究即為國際上第一篇利用高解析度冷凍電顯結構來明確探討酶學的文章。」他也提到，目前有將近70個研究計畫正在冷凍電顯中心運作，成果也將開始顯現。本研究在冷凍電顯團隊張淵智研究副技師等人的協助下，不到一年的時間即有傑出成果。

此外，本研究也發現了KARI酵素可能有助生產生質燃料的關鍵特性。一般而言，酵素對幫助其作用的輔酶具高度專一性，有如同「一個鎖孔對一把鑰匙」的關係，但是，KARI這個酵素卻可使用兩種輔酶（NADH與NADPH）。透過冷凍電顯技術，本研究也掌握了其「一個鎖孔適用不同鑰匙」之門路，也就是KARI酵素對輔酶的雙重特異性。這除了是本研究的獨道之處，也讓基因工程學家可藉此繼續探索於工業應用KARI酵素的可能性。

近年來，本院院長廖俊智院士以及2018年諾貝爾化學獎得主弗朗西絲·阿諾德（Frances Hamilton Arnold）博士利用微生物基因工程，修改大腸桿菌支鏈型胺基酸的生物合成途徑，來生產生質燃料──異丁醇。而因為NADH的成本較NADPH低，阿諾德長期以來研究如何讓KARI酵素對NAPDH的偏好改成NADH，以生產更多異丁醇。因此，本次本院及中央大學團隊對此酵素特性的掌握，將有高度的工業應用價值。

陳青諭也不諱言，此次研究的亮點之一，是她萬念俱灰下的靈光乍現。當時酵素結構的解析度有做出來，但卻一點活性也沒有，面臨可能失敗重來的沮喪，讓她整整苦惱了一個多月。停下腳步重新思考後，她意外掌握到酸鹼值這項關鍵因素，同時也利用冷凍電顯結構揭示了這個酵素的活性如何受到酸鹼值的影響。

陳青諭過去在本院王惠鈞院士及陳長謙院士共同指導下，於本院化學所開始冷凍電子顯微鏡技術的研究之路。她表示：「現今高解析冷凍電子顯微鏡如虎添翼，利用電顯對蛋白質分子拍照，可取得成千上萬個不同面向的個別蛋白質分子影像，以數學方法來重構，可達近似原子等級的解析度，將蛋白質結構看得一清二楚，也是一大突破！」

此篇研究不僅是眾多研究人員的成果，也是本院冷凍電顯中心的作品，對長期給予冷凍電顯研究經費支持的臺灣蛋白質計畫有莫大鼓舞，而除了冷凍電顯團隊，臺灣蛋白質計畫也大力扶植與癌症或重大疾病醫療檢測相關之蛋白質結構分析、抗體及藥物開發等多個研究團隊。

本研究論文標題為Use of Cryo-EM to Uncover Structural Bases of pH Effect and Cofactor Bispecificity of Ketol-acid Reductoisomerase

論文網址 : https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b01354

● 中央研究院冷凍電顯中心（ASCEM）：http://cryoem.ibc.sinica.edu.tw

● 臺灣蛋白質計畫（TPP）官網：http://tpp.ibc.sinica.edu.tw/

作者群 : Chen CY, Chang YC, Lin BL, Lin KF, Huang CH, Hsieh DL, Ko TP, Tsai MD*

更新時間 : 2019.04.18

[註1] 原子有多小？如果將原子看成一顆蘋果的大小，那原來的蘋果就會跟著放大到地球的大小。（ “If an apple is magnified to the size of the earth, then the atoms in the apple are approximately the size of the original apple.”）

圖說：論文已於4月17日刊載於《美國化學學會期刊》（Journal of the American Chemical Society），期刊並將研究成果選為當期封面，呈現藝術創作般的蛋白質酵素3D立體結構圖。

圖說：冷凍電子顯微鏡下的蛋白質影像。

圖說：低階及高階冷凍顯微鏡成像解析度之差異。（左二為低階之影像，右二為高階之影像，解析度提高至原子層次）。

圖說：中研院的一組高階電子顯微鏡。Titan Krios（左）及Talos Arctica（右）。